Gen muhandisligi fermentlari va ularning roli

Slayd 1

Gen muhandisligi fermentlari

Slayd 2

Reja
Fermentlarni o‘rganish obyekti va subyekti.
Asosiy fermentlar va ularning ahamiyati.

Slayd 3

Genetika muhandisligi molekulyar genetikaning davomidir, lekin uning tug’ilishi genetik enzimologiya va nuklein kislotalar kimyosining muvaffaqiyatlariga asoslangan, chunki fermentlar molekulyar manipulyatsiya vositalaridir. Ba’zida mikromanipulyatorlar yordamida hujayralar va hujayra organellalari bilan ishlashimiz mumkin bo’lsa-da, hatto eng kichik mikrojarrohlik asboblari DNK va RNK makromolekulalari bilan ishlashda yordam bermaydi. Nima qilsa bo’ladi? Fermentlar «skalpel», «qaychi» va «tikish uchun ip» vazifasini bajaradi. Faqat ular ma’lum nukleotidlar ketma-ketligini topa oladi, u yerda molekulani «kesadi» yoki aksincha, DNK zanjiridagi teshikni «yamoqlaydi».

Slayd 4

Shuni ta’kidlash kerakki, gen injeneriyasida qo’llaniladigan fermentlarda turlarning o’ziga xosligi yo’q, shuning uchun eksperimentator o’zi tanlagan ketma-ketlikda har qanday turdan olingan DNK qismlarini bir butunga birlashtira oladi. Bu genetik muhandislikka tabiat tomonidan o’rnatilgan turlar to’siqlarini yengib o’tishga va turlararo birlashishni amalga oshirishga imkon beradi.

Slayd 5

Gen muhandisligida rekombinant DNKlarni konstruksiyalashda ishlatiladigan fermentlar quyidagi guruhlarga bo‘linadilar:
DNK fragmentini olish uchun ishlatiladigan fermentlar (restriktazalar);
DNK matritsasidan DNKni (DNK-polimerazalar)
DNK matritsasidan RNKni (RNK-polimerazalar)
RNK matritsasidan DNKni (teskari transkriptazalar) sintezlovchi fermentlar;
DNK fragmentlarini birlashtiruvchi fermentlar (ligazalar);
DNK fragmenti uchlari strukturasini o‘zgartiruvchi fermentlar.

Slayd 6

Нуклеазалар – нуклеин кислотлар молекулалари гидролизи реакцияларини катализловчи ферментларнинг йирик гуруҳи.
Нуклеазаларнинг ҳужайрадаги дастлабки вазифаси – ҳаётий жараённинг айни вақти учун кераксиз бўлган молекулалари (масалан, мРНК ни трансляциядан сўнг) деградациясини ва нуклеин кислотларни бегона молекулалардан ҳимоя қилиш (бактерия фаг билан зарарланганда фаг ДНК сини бактерия нуклеазалари томонидан парчалаб юборилиши) дан иборат.
Нуклеазалар таъсирига кўра: ДНК молекулалари (ДНКазалар)га, РНК молекулалари (РНКазалар)га, ДНК ва РНК га бир вақтнинг ўзида (олтин ранг ловия нуклезаси) бир хилда таъсир этиши мумкин.
Нуклеазалар бир занжирли (S1 нуклеазаси) ёки қўш занжирли (экзонуклеаза III) ДНК молекулалари, ёки гибрид ДНК-РНК молекуласи (рибонуклеаза H) га таъсир этиши мумкин.

Slayd 7

Функциясига кўра нуклеазаларни икки типга: экзонуклеазалар ва эндонуклеазаларга бўлиш мумкин.
Экзонуклеазалар, одатда, молекулаларни 5¢ ёки 3¢ эркин учларидан бошлаб гидролизлайди.
Эндонуклеазалар ДНК молекуласи бўлаги ёки халқасимон ДНК молекуласининг ички кетма- кетликларидан бошлаб парчалайди.

Slayd 8

Рестриктазалар (рестрицияловчи эндонуклеазалар)
ДНК молекуласида маълум бир нуклеотидлар кетма-кетлиги (рестриция сайтлари)ни таниб, уларга «ҳужум қилувчи» ферментлардир.
1968 йили Мезелсон ва Юанлар метилланмаган ДНКни парчаловчи рестриктазани ажратиб олишган. 1970 йили еса Смит ва Вилкокс Haemophilus influenzae дан ДНКнинг аниқ бир кетма-кетлигини парчаловчи биринчи рестриктаза (Hind III)ни ажратиб олишган.
Ҳозирги вақтда турли хил микроорганизмлардан мингдан ортиқ ҳар хил рестриктазалар ажратиб олинган. Ген муҳандислигида 200 дан ортиқ тури кенг қўлланилмоқда.
Рестриктазалар эндонуклеазаларнинг ДНКни муайян махсус кетма- кетликлари рестрикция сайтлари (нуқталари)ни ҳосил қилиб гидролиз қиладиган гуруҳи ҳисобланади. Ҳар бир рестриктаза ўзининг рестрикция сайтини танийди ва ДНКни рестрикция сайти изчилликлари ичидан ёки унинг атрофидан бошлаб қирқади
Рестриктазаларни номлашда фермент ажратиб олинган бактерия турининг лотинча номини бош ҳарфлари ва қўшимча белгиларидан фойдаланилади. Чунки бир турдаги бактериялардан бир неча хил рестриктазалар ажратиб олинган бўлиши мумкин. Esсheрichia Coli-EcoR I, EcoR V, Haemophilуs inflуenzae –Hinf I, Stрeptomyces albуs – Sal I, Theрmуs aqуaticуs – Taq I.

Slayd 9

Slayd 10

Палиндром бу – ДНК икки занжирли молекуласининг, 5′- дан 3′- га қараб ўқиб борилганда иккала учи бир ҳил нуклеотид кетма-кетлигига эга соҳаси. Бундай соҳалар кўпинча II типдаги рестрицирестрикцияловчи эндонуклеазалар томонидан таниб олинади.
II типдаги рестрикцияловчи эндонуклеазалар томонидан аниқланадиган ва ДНК молекулалари парчаланадиган палиндром кетма-кетликлар таниш сайтлари деб аталади.
Таниш сайтлари тўрт, беш, олти, саккиз ва ундан кўп нуклеотидлардан ташкил топиши мумкин. Таниш сайти узунлигидан унинг ДНК молекуласида тарқалиш тезлиги боғлиқ бўлади; кўпчилик ҳолатларда тетра- ва гексануклеотидларни танийдиган рестриктазалар қўлланилади.

Slayd 11

II-типдаги рестриктазалар рестрикция сайтлари ўлчами ва олинадиган ДНК бўлаклари узунлигига кўра, бир неча синфга бўлинади:
майда бўлакка бўлувчилар– рестрикция сайтлари тўртта нуклеотид жуфтликлардан иборат;
ўрта бўлакка бўлувчилар– 6-8 н.ж. рестрикция сайтлари;
йирик бўлакка бўлувчилар- 10-14 н.ж. рестрикция сайтлари
Рестриктазаларнинг фермент фаоллигифаоллик бирликларида ўлчанади. Бу оптимал шароитда l фаг ДНК сини 1 мкг миқдорини 1 соат ичида тўлиқ гидролизланиши учун сарф бўладиган фермент миқдорига тенгдир. Рестрикциянинг оптимал шароити ҳар бир рестриктаза учун алоҳида бўлиб, у pH, ион кучи, тегишли ионлар мавжуд бўлиши, реакцияни амалга ошириш ҳароратига боғлиқ бўлади.

Slayd 12

Toʻmtoq uchli fragmentlar oʻzaro DNK ligazalar yordamida biriktiriladi. Lekin toʻmtoq uchli fragmentlar qiyin bogʻlanadi (samarasi va natijasi yaxshi chiqish ehtimoli kam), chunki ularda DNK molekulasini ushlab turuvchi zinapoyasimon oxirlar mavjud emas.
DNK ligazasi ATFdan foydalangan holda DNK zanjirining 5ʼ uchiga yopishgan fosfat guruhi boshqa zanjirning uchiga yopishgan gidroksil guruhi bilan bogʻlanadi. Ushbu reaksiya yaxlit uglevod-fosfat asosni hosil qiladi.

Slayd 13

ДНК лигаза
1961 йилда Мезельсон ва Вейгл рекомбинация ДНК молекулаларининг парчаланиши ва кейинчалик қайта қўшилиши билан боғлиқлигини кўрсатди. ДНК бўлакларини ўзаро боғлашда иштирок этадиган фермент 1967 йилда топилди ва ДНК лигаза деб номланди.
ДНК лигазалар 2 занжирли нуклеин кислота молекуласида фосфодиэфир боғланишни таъминлайди.
ДНК лигазалари AМФ донори сифатида фойдаланадиган кофакторига қараб икки оилага бўлинади:
AТФга боғлиқ лигазалар – бактериал ва еукарётик вируслар, архея, хамиртуруш, сутемизувчилар ва еубактерияларда учрайди.
НAД+ габоғлиқ ДНК лигазалари деярли фақат еубактерияларда учрайди.

Slayd 14

ДНК лигаза қўшни нуклеотидлар орасидаги фосфодиэфир боғларини тиклаш орқали ДНК бўлакларини боғлаш каби асосий вазифани бажаради. Бу жараён лигирлаш деб аталади.
Ген муҳандислигида кўпинча лигирлаш учун Т4 фагининг ДНК-лигазасидан фойдаланилади. Т4 лигаза ёрдамида ДНК нинг ҳар қандай бўлаги “ёпишқоқ учли” ёки “тўмтоқ учли” қисмлари бириктирилади. Бу энг кўп қўлланиладиган ферментлардан биридир.

Slayd 15

E’tiboringiz uchun rahmat!

Slayd 16

Foydali havolalar

🛒 Barcha taqdimotlar | 📰 Yangiliklar | ℹ️ Biz haqimizda