Aminokislotalarni yupqa qavatli xromatografiya usuli bilan aniqlash

Slayd 1

Aminokislotalarni yupqa qavatli xromatografiya usuli bilan aniqlash

Slayd 2

Ishning mazmuni: Aminokislotalarni bir-biridan ajratishda eng oddiy, oson va nisbatan aniq usul qogʻoz xromatografiyasidir. Xromatografiya usuli 1903 yilda rus olimi M. S. Svet tomonidan kashf etilgan. Qogʻoz xromatografiyasi uchun yuqori sifatli har qanday filtr qogʻozdan foydalanish mumkin. Aminokislotalarning ajratish va aniqlash usuli, ularning aralashmasini filtr qogʻozga tomizishdan va qogʻozning bir uchini tegishli organik erituvchiga tushirishdan iborat. Erituvchi filtr qogʻoz tomonidan shimiladi va oʻzi bilan birga aminokislotalarni koʻchiradi (ilashtiradi). Aminokislotalarni qogʻoz boʻylab koʻchirilish tezligi ularning ximiyaviy tuzilishiga, erituvchilarda erish darajasiga bogʻliq boʻladi. Ayrim aminokislotalar turli xil eritmalarda turlicha erish xususiyatiga ega. Odatda bu eritmalardan biri suv, ikkinchisi esa suvda toʻydirilgan organik erituvchi boʻladi (fenol, butil spirti va boshqalar). Odatda suv bilan aralashmaydigan yoki qisman aralashadigan organik erituvchilardan foydalaniladi.

Slayd 3

Ishning maqsadi: aminokislotalarni xromatografik usulda ajratish haqida maʼlumot berish, oʻtkaziladigan tajribalar orqali talabalarga aminokislotalar xromotagrammalarini koʻrsatish.
Aminokislota bosib oʻtgan masofaning (a) eritma bosib oʻtgan masofaga (v) boʻlgan nisbati aminokislotalarning ajralish koeffisiyenti deb ataladi (2-rasm). Aminokislotalarning ajralish koeffisiyenti (Rf) har bir aminokislota uchun berilgan eritmada doimiy boʻlib, u quyidagicha aniqlanadi.
Qogʻoz xromatografiyasida aminokislotalar ikki usul yordamida ajratiladi. Bu pastga va yuqoriga harakat qiluvchi xromatografiya usulidir. Bundan tashqari yana bir tomonlama va ikki tomonlama xromatografiya usuli ham mavjud. Bir tomonlama xromatografiya usulida moddalarning ajralishi bir yoʻnalishda boʻladi. Bunda Rf yaqin boʻlgan aminokislotalar bir-biriga qoʻshilib 2 — 3 tadan boʻlib ajraladi. Ularni bir-biridan ajratish uchun ikki tomonlama xromatografiya usulidan foydalaniladi. Bunda ikkita organik erituvchi ishtirok etadi. Ajratish ketma-ket ikkita oʻzaro perpendikulyar yoʻnalishda olib boriladi.

Slayd 4

Ish tartibi. 1-ish. Filtr qogʻozdan uzunligi 12 — 14 sm va eni 1,5 sm keladigan lenta qirqiladi. Bu lentaning yuqori tomonidan igna bilan 15 — 20 sm ip oʻtqaziladi. Qogʻozni pastki qismidan 1 sm qoldirib toʻgʻri chiziq va uning oʻrtasiga diametri 0,5 sm boʻlgan aylana chiziladi. Aylana oʻrtasiga kapillyar yordamida 2 — 3 tomchi aminokislota aralashmasi tomiziladi. Tomchi tomizilgan joy havoda quritiladi. Uzunligi 18 —20 sm va diametri 2 sm boʻlgan probirkaning tubiga sekin-astalik bilan probirka devorlariga tekkizmasdan suv bilan toʻyintirilgan fenol eritmasidan 2 ML quyamiz. Tayyorlagan qogʻoz lentaning ipini ushlab turib probirkaga tushiramiz, bunda qogʻozning uchi erituvchiga 2 — 3 MM botib, qatʼiy ravishda vertikal turishi kerak. Probirkani probka bilan berkitib 40 — 50°S temperaturada 1,5 — 2 soat davomida termostatga qoʻyamiz. Probirkadagi eritma qogʻoz lenta boʻylab 10 — 12 sm koʻtarilgandan keyin xromatogrammani olib 100°S da 10 — 15 minut davomida quritamiz. Soʻngra xromatogrammaga ningidrinning 0,1 % LI eritmasi purkaladi yoki eritmaga botirib olinadi. Keyin 100°S temperaturada 5 — 10 minut davomida quritiladi. Xromatogrammada rangli dogʻlar hosil boʻladi. Dogʻlarning Rf i aniqlanib jadval (ilovaga qarang) dan qaysi aminokislota ekanligi aniqlanadi. Aminokislotalarning bir-biridan ajralishi aniq boʻlishi uchun odatda Rf bir-biridan koʻproq farq qiluvchi aminokislotalar aralashmasi olinishi kerak.

Slayd 5

Aminokislotalarni Xromatografik Usulda Ajratish
Kerakli asbob va reaktivlar: eni 1,5 sm, uzunligi 12-15 sm boʻlgan filtr qogʻoz, ip, qora grafit qalam, kapillyar yoki mikropipetka, diametri 2-2,65 sm, uzunligi 18-20 sm LI probirka, pipetkalar, termostat, quritgich shkaf, pulverizator, diametri 12 sm LI filtr qogʻoz, oʻlchov birobirkasi, filtr qogʻoz, qaychi, pinset, lineyka, Petri kosachasi, glyutamin kislota, alanin, leysin, toʻyingan fenol yoki butanol eritmasi, oʻsimlik yoki hayvon toʻqimasidan ajratib olingan ekstrakt.
Hozigi vaqtda oqsillar, aminokislotalar, nuklein kislotalar, uglevodlar, lipidlar va boshqa metabolitlarni (moddalar almashinuvining oraliq mahsulotlarini) bir-birini ajratish uchun xromatografik usuldan foydalaniladi.
Moddalarni ajratish mxanizmiga qarab xromatografiyaning bir necha turlari bor – chunonchi adsorbsion, tarqatuvchi, diffusion xromatografiya, ion almashinuv xromatografiyasi, gaz xromatografiyasi, affin xromatografiyasi va boshqalar.
Hozirgi zamon xromatografik usullari oz miqdordagi murakkab aralashmalardan alohida komponentlarni juda tez ajratib olishga imkon beradi.

Slayd 6

Bu usulning mohiyati shundaki, xromatografik qogʻozning bir nuqtasiga yoki bitta chiziq boʻylab tekshirilayotgan aminokislotalar aralashmasi yoki oqsil gidrolizati tomizilib quritiladi, soʻng qogʻozning shu chekkasi erituvchilar aralashmasiga tushiriladi. Erituvchi kapillyar kuchlar yordamida qogʻoz boʻylab harakatlanadi va oʻz yoʻlida uchragan moddalarni, xususan aminokislotalarni eritib harakatlanadi. Aminokislotalarning qogʻoz boʻylab harakati – eruvchanligi ularning ximiyaviy tuzilishi va xossalariga bogʻliq. Erituvchi qogʻozning ikkinchi chekkasiga yaqinlashganda prosess toʻxtatiladi, xromatografik qogʻoz erituvchi toʻla bugʻlanib ketguncha quritiladi. Shundan keyin xromatogrammaga aminokislota bilan rang beruvchi reagent – ningidrin eritmasi purkaladi. Natijada qogʻozning har xil zonalarida rangli dog’ – aminokislota dogʻlari paydo boʻladi, bu esa aminokislotalarning bir – biridan ajragandan darak beradi.

Slayd 7

Alohida aminokislotalarning siljish tezligi taqsimlanish koeffisienti (Rf) bilan ifodalanishi mumkin. Taqsimlanish koeffisenti deb aminokislota tomizilgan joydan aminokislota dogʻining markazigacha boʻlgan masofa (millimetrlarda) (a) ning start nuqtadan erituvchi frontigacha boʻlgan masofaga nisbatiga aytiladi.
1- rasm. Yuqoriga koʻtariluvchi xromatografiya:
1 – keng diametrli probirka; 2 – tiqin (probka);
3 – xromatografiya qogʻozi; 4 – xromatografiya qogʻozini ilib qoʻyish uchun ip; 5 – erituvchi sistema; 6 – start nuqta; 7 – erituvchi fronti;
8 – xromatogramma

Slayd 8

Biz quyida xromatografiyaning ikkita oddiy usuliga: a) yuqoriga qoʻtariluvchi xromatografiya, b) radial xromatografiyaga toʻxtalib oʻtamiz.
1-usul. Yuqoriga koʻtariluvchi xromatografiya.
Ishning bajarilishi. Eni 1, sm, uzunligi 12-15 sm keladigan filtr qogʻoz kesib olinib, yuqori qismiga 15-20 sm uzunlikda ip oʻtkazib bogʻlab qoʻyiladi. Qogʻoz lentaning pastki chekkasidan 1 sm yuqoriga 3-4 MM diametda qora grafit qalamda doira chizib qoʻyiladi. Doiraning oʻrtasiga kapillyar yoki mikropipetka yordamida aminokislota aralashmasi (masalan, glyutamat kislota, alanin va leysin aralashmasi) tomiziladi va quritiladi.
Diametri 2-2,5 sm, uzunligi 18-20 tomchi suvga toʻyingan fenol quyiladi. Tayyorlangan qogʻoz lentani bogʻlangan ipdan ushlab 2-3 MM chuqurlikka – erituvchiga botguncha tushirib, qogʻozni probirka devoriga tekkizmay va aniq vertikal holatini saqlab, probka bilan bekitib qoʻyiladi. Probirka 35-400 LI termostatda 90-120 minut davomida qoldiriladi. Shu vaqt ichida erituvchi fronti 10-12 sm ga koʻtariladi. Koʻrsatilgan vaqt oʻtganadan keyin xromatogramma olinib, 10-15 minut davomida – to fenol yoki boshqa erituvchi batamom uchib ketguncha 50-1000 LI quritgich shkafga osib qoʻyiladi.

Slayd 9

Erituvchi uchib ketgach, qogʻoz lentani olib shtativga ilib qoʻyiladi va unga 0,1-0,5 % LI ningidrin eritmasidan pulverizator yordamida purkaladi yoki kyuvetaga ningidrin eritmasi quyib, unga xromatografik qogʻoz botiriladi. Yana 100-1100 LI quritgich shkafga 5-6 minut ilib quyiladi. Natijada qogʻozning aminokislota toʻxtagan joyi koʻk, koʻkish-binafsha rangga boʻyaladi. Keyin lineyka yordamida har bir aminokislota uchun Pf-aniqlaniladi.
2-usul. Radial xromatografiya.
Ishning bajarilishi. Radial xromatografiya uchun 12 sm diametrli (Petri kosachasi diametridan kattaroq) qogʻoz diskni qalam bilan 4 teng qismga boʻlib, oʻrtasiadan diametri 1 sm LI teshik ochiladi va har bir sektorning boshlanishida start nuqta uchun qalam bilan doira chiziladi.
2-rasm. Radial xromatografiya.
A – xromatografiya qogʻozi, b – xromatogramma; v – Petri kosachasi:
1- alanin; 2 – glutamin kislota; 3 – leysin; 4 – aminokislotalar aralashmasi.

Slayd 10

Filtr qogʻozdan balandligi 2 sm boʻlgan naycha shaklidagi oyoqcha tayyorlab xromatografik disk oʻrtasiadagi teshikka oʻrnatiladi. Soʻngra Petri kosachasining qopqogʻiga qoʻyib, xromatografik qogʻozning har bir qismidagi start doiraga kapillyar yordamida quyidagi aminokislota tomiziladi: 1) alanin, 2) glutamin kislota, 3) leysin, 4) aminokislotalar aralashmasi. Petri kosachasining tag qismiga 10 ML suvga toʻyintirilgan fenol quyib, ohistalik bilan qogʻoz pilik erituvchiga tegib turadigan qilib joylashtiriladi va 1 soat davomida xona temperaturasida qoldiriladi. Petri kosachasini shunday tanlash maʼqulki, ostki va ustkki (qopqoq) qismining diametri teng boʻlsin. Natijada jips berkitilgan kamera hosil boʻladi. Koʻrsatilgan vaqt ichida erituvchi xromatografik qogʻoz chekkasiga borgan boʻlsa, qopqoq ochilib pinset yordamida xromatografik diskni chekkasidan ushlab 10 minut davomida 100-1200 LI qurituvchi shkafga yoki termostatga qoʻyiladi. Bu vaqt ichida erituvchi batamom uchib qetadi va aminokislotalar ham fiksatsiyalanadi. Soʻngra xromatogrammani gorizontal holatga qoʻyib, pulverizator bilan ningidrin eritmasidan purkaladi va 5-10 minut davomida 100-1200 LI termostatga qoʻyiladi. Xromatogramma daftarga yopishtirib qoʻyiladi yoki rasmi chizib olinadi. Lineyka yordamida masofalar oʻlchanib, har bir aminokislota uchun Rf aniqlaniladi.

Slayd 11

E’tiboringiz uchun rahmat!

Slayd 12

Foydali havolalar

🛒 Barcha taqdimotlar | 📰 Yangiliklar | ℹ️ Biz haqimizda